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39段和载体的摩尔数是3 以保证较高的连接效率。16 连接过夜。 Ca

发布时间:2019-06-25 02:21 来源:未知 编辑:admin

  39段和载体的摩尔数是3 以保证较高的连接效率。16 连接过夜。 CaCl2常法大肠杆菌细胞感受态的制备 先用接种环在菌种中蘸取少量含有菌株的解冻菌液然后在培养皿上分区划线 然后置于恒温培养箱继续培养。 待培养皿上长出笔芯大小的单个克隆后用200微升的黄色枪头挑取单个菌落 然后接种到含有4ml的LB

  39段和载体的摩尔数是3 以保证较高的连接效率。16 连接过夜。 CaCl2常法大肠杆菌细胞感受态的制备 先用接种环在菌种中蘸取少量含有菌株的解冻菌液然后在培养皿上分区划线 然后置于恒温培养箱继续培养。 待培养皿上长出笔芯大小的单个克隆后用200微升的黄色枪头挑取单个菌落 然后接种到含有4ml的LB无抗培养基的摇菌管中 在置于37 恒温摇床中 设置250rpm的转速 活化过夜 12 18小时 取上述活化的大肠杆菌菌液2ml再次接种到有200ml的LB无抗培养基的锥形烧瓶中 在置于37 恒温摇床中 设置250rpm的转速继续培养3 5小时 至OD600值为0 取上述达到OD值达标的菌液与50ml离心管中置于4 以10000rpm转速离心1分钟然后弃掉上清。 在加入40ml冰上预冷的01M氯化钙 轻轻振荡摇晃并重悬菌体沉淀 冰浴30分钟 以10000rpm转速离心1分钟 然后弃掉上清。 向离心管中在加入5ml冰预冷的01M氯化钙 轻轻振荡摇晃并重悬菌体沉淀 然后加入10 的甘油。200微升分装后保存到 80 分别将10微升连接过夜的产物加入200微升刚刚解冻的感受态细菌中轻轻混匀 然后冰浴30分钟。 在恒温水浴槽中42热休克90秒钟 立即置于冰上2分钟。 试剂 用量 DNA片段连接混合体系 总体积10μl 加入温度平衡至室温的无抗LB培养基500微升置于37 恒温摇床中 设置250rpm的转速 37 活化1小时。 用台式离心机2000rpm离心2分钟后留下100微升体积 弃去残余上清培养基后轻轻重悬细菌沉淀。 将该重悬细菌沉淀用无菌200微升黄枪头吸取后滴在含有氨苄抗生素的平板上然后用涂布玻璃棒均匀铺平菌液 最后置于恒温培养箱中37 培养过夜。 待培养皿上长出笔芯大小的单个克隆后用200微升的黄色枪头挑取单个菌落 然后接种到含有4ml的LB无抗培养基的摇菌管中并做好标记 然后将摇菌管置于37 恒温摇床中 设置250rpm的转速培养过夜。 保存以便下一步鉴定分析。 质粒小提 分别取15ml菌液放于1 5ml EP管中 12000rpm离心倒置去掉上清 加入100微升的溶液I 放在漩涡剧烈振荡至完全悬浮。 加入200微升的溶液II轻轻颠倒混匀数次 然后冰浴静置5分钟至整个溶液澄清。 加入在冰箱中预冷的溶液150微升 轻轻摇晃混匀数次 冰浴10分钟 至澄清溶液中出现絮状。 用台式离心机412000rpm离心 10 15分钟 小心吸取上清至1 5ml EP管中 然后加入等体积无水乙醇 上下颠倒 用台式离心机在室温下12000rpm离心 15分钟 倒置去掉上清 然后加入70 乙醇500微升 洗涤数次。 用台式离心机在室温下12000rpm离心 15分钟 倒置去掉上清 抽干液体 室温下干燥10分钟。 沉淀溶于30微升TE加RNaseA 溶液中 37 水浴保温30分钟。获得质粒DNA可以直接用于下游的测序和酶切鉴定。 酶切鉴定 上述通过质粒小提的含有DDAH1 396 4N 缺失 插入 多态性位点不同等位基因启动子区DNA片段的T载体可以利用Hind 和BglII两个限制性内酶切酶进行酶切 做20微升反应体系 具体配置如下 41反应在37 恒温水浴槽中1 2个小时。 PCR鉴定 以上述通过质粒小提含有不同等位基因的T载体作为模板 可以PCR扩增出预计大小的片段做一个快速的鉴定 做25微升反应体系 具体配置如下 PCR扩增反应程序如下 96 1分钟 96 30秒 56 30秒 72 1分钟 72 10分钟 保温上述反应在ABI 9700型 PCR仪上进行扩增。 扩增结束后 通过跑琼脂糖凝胶电泳 根据片段大小来鉴定构建成功阳性克隆。 测序鉴定 以上通过酶切鉴定或者PCR扩增鉴定正确的阳性克隆 先通过甘油保种冻存于 80 冰箱 然后取部分剩下菌液按照通过前面论述的具体测序方法在3130xl全自动遗传分析仪上进行测序 最后通过测序序列分析确认来克隆片段的正确性。 试剂 用量 质粒DNA 去离子水15μl 总体积 20μl 试剂 用量 质粒DNA 上下游引物10pmol 10PCR Buffer ExTaqTM 去离子水18μl 总体积 25μl 35个循环 42DDAH1 396 4N 缺失 插入基因型克隆片段与pGL3 Basic载体的连接、鉴定 将鉴定正确质粒按照100微升体系 选用Hind 和BglII两个限制性内酶切酶进行酶切 然后进行琼脂糖凝胶电泳和不同基因型目的片段的片段回收。同样我们对pGL3 Basic空载体也进行质粒小提 抽提出来的质粒也选用上述两个限制性内切酶进行酶切 然后进行琼脂糖凝胶电泳和空载体的片段的回收。 回收的片段进行电泳定量或者分光光度计定量。为了保证较高的连接效率 我们进行连接反应的时候 同样要注意插入片段和载体的摩尔数是3 1。具体连接体系见下表 以上反应在16 下连接过夜 然后按照转化 挑选阳性克隆步骤 鉴定出所需要的构建正确的载体。最后鉴定正确的质粒 通过测序再次确认鉴定或者通过酶切法再次鉴定构建正确性以及不同的基因型 分别命名为pGL3–4N del pGL3–4Nins。 无内毒素质粒大提 为了提高转染效能 我们采用无内毒素质粒大提试剂盒进行含有不同基因型的报告基因载体pGL3–4N del pGL3–4Nins质粒以及购自于美国Origene 公司pCMV XL5 hMTF1和pCMV XL5质粒提取。 首先将构建正确或者鉴定正确带有不同质粒冻存的菌株解冻接种于含有氨苄抗生素的 200ml LB培养基中 然后置于37 恒温摇床中 选择250rpm的转速 37 培养过夜 12 18小时 取200ml菌液室温下在大容量离心机以4500 g离心20分钟 收集沉淀菌液。 按照说明书使用说明要求在开始使用该试剂盒前 我们先将RNaseA与Solution I试剂 用量 DNA片段连接混合体系 pGL3Basic双酶切后空载体 总体积10μl 43混合 并长期4度保存。去掉培养基 留下菌体。再向上述菌体中加入10ml的加入RNaseA与Solution I混合液 使用漩涡振荡器是细菌菌体完全重悬。 向重悬混合液中加入10ml的SolutionII 轻轻颠倒混匀10次左右 然后将混合液体室温放置约2分钟左右 但时间不要超过5分钟。 然后加入5ml冰浴的BufferN3 并温和颠倒离心管数次至形成白色絮状沉淀。 准备好过滤器具。把HiBind大提柱子放入大的收集管中 按照说明书要求 向该柱子中加入5ml的 Buffer GPS 10分钟。室温5000g离心5分钟。去除滤液 将收集柱子重新放回收集管中。 在过滤澄清的裂解液中加入10分之一体积的ETR颠倒10次后溶液将变浑浊 然后冰浴10分钟。 在恒温水浴槽上设定42水浴5分钟后 25 5000 g离心5分钟 此时会发现在管底会有蓝色分层。 10 转移上清液至离心管中 加入0 5倍体积的无水乙醇 室温下静置2分钟。 11 把Hi Bind大提收集柱子放入50ml的收集管中。转移20ml混合液体至柱子中 室温下以5000 g离心5分钟去掉废液。 12 重复上述步骤一次 然后将剩余的液体再次经过滤柱滤出一次。 13 把收集柱放入50ml收集管中 加入10ml的 HB缓冲液 室温下以5000 g离心5分钟去掉废液。 14 把收集柱放入50ml收集管中 加入15ml的 DNA洗脱缓冲液 室温下以5000 g离心5分钟去掉废液。重复此步骤一次。注意DNA洗脱缓冲液在洗脱前 先加入200ml的无水乙醇。 15 把收集柱子重新放回50ml的收集管中 室温下以6000 g离心15分钟。采用线分钟。重复该步骤一次。 16 把干燥好的收集柱子放入干净的50ml的离心管中 加入70 预热的无内毒素析出缓冲液 室温下静置2分钟 6000 g离心5分钟洗脱收集DNA。收集的DNA通过分华 44光光度计测量纯度和浓度 20度保存备用。 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存好的细胞并迅速置于37 恒温水浴槽中 摇动冻存管使之解冻。取出后 用酒精喷雾瓶喷撒70 无水乙醇 并用棉花擦干净。 在超净工作台中用70 无水乙醇再次喷雾擦拭外周后 小心旋开冻存管管盖 将解冻的细胞用无菌的移液器转移到预热的无血清培养基的无菌离心管中 轻轻洗涤细胞。采用低速离心 800rpm 10分钟 弃掉上清 重新洗涤一次。 再次低速离心800rpm 10分钟后得到的细胞沉淀用3ml完全培养基重悬后 转移至25ml的的细胞培养瓶中 再补加适量完全培养基。 将上述细胞培养瓶置于5C02、37 恒温培养箱中培养 细胞贴壁后 置换新的培养基。 细胞培养和传代 在培养箱中以含有小牛血清的DMEM完全培养基培养细胞。根据不同的细胞种类和不同的细胞状态选择合适的血清浓度 一般推荐在10 20 之间。本实验中所有细胞小牛血清选择10 的血清浓度。对于HUVEC细胞系 我们还需要额外添加50ng ml的生长因子 sigma公司 和肝素盐100 ml。细胞生长铺满瓶底倒掉培养基 加入6ml的PBS缓冲液 吹打洗涤细胞 去掉缓冲液。加入1毫升的胰酶 置于37 约5分钟 并在相差显微镜观察消化情况 然后加入4毫升培养基中和胰酶。然后吸取少量细胞悬液 进行细胞计数 然后根据计数结果加入培养基来调整细胞浓度。最后 吸取定量的培养基到新的培养瓶中 C02、37恒温培养箱中培养。 细胞冻存 待细胞增殖生长进入对数生长期 在冻存前一天进行换液。配置冻存细胞冻存液 一般推荐按照7份培养基 1份DMSO和2份胎牛血清的比例进行混合配比。根据上述细胞培养传代的操作流程 将细胞最终保存浓度调整至5 106 ml 分装到2ml的冻存管中 5ml每支保存。先在4度冰箱保存半个小时然后 80 放置一天 最后转入液氮罐中冻存。 45细胞转染 细胞瞬时转染是按照Lipofectamine2000 Invitrogen 转染试剂盒说明书具体操作步骤进行的。 按照前面叙述细胞传代操作过程消化细胞 将细胞浓度调整至2 106ml后接种24孔板。 细胞生长1824小时后 细胞密度达到60 80 可以做转染。 转染前先用无抗的DMEM培养基洗涤细胞然后在向24孔板每孔中加入750微升无抗无血清的DMEM培养基。 用125微升的OPTIMEM I加入2微升的脂质体2000混合 室温放置5分钟。 另外的125微升的OPTIMEM I与经过大量无内毒素质粒混合。每孔加入0 8微克的 pGL3 4N del pGL34N ins。而pCMV XL5 hMTF1量为160、640、800ng。 共转染的pRL TK质粒的量为40ng。 室温静置20分钟。向每个24板孔中加入250微升上述混合液体 每个组别重复3个孔。于5 C02、37 恒温培养箱中培养24小时后换液检测荧光活性。 双报告基因荧光素酶活性检测 首先将5PLB Pssive Lysis Buffer 用去离子水稀释成l 的工作作液 然后将12孔板中的培养基吸净 用PBS洗涤三遍。 向每个孔中加入约150微升的PLB溶液摇床室温振摇15分钟 使细胞完全裂解 并在相差显微镜下观察裂解情况 并根据裂解情况酌情延长或者缩短室温下的裂解时间。 按照说明书的要求将棕色瓶中的Lyophilized Lucfferase Assay Substrate与l0ml Luciferasc Assay Buffer II混匀 制备成LARII 80 保存备用。 根据说明书要求准备相应体积的Stop Glo Reagent 将50x的Stop Glo Reagent与50倍体积的Stop Glo Buffer混匀 80 保存备用。 打开Modulus多功能光度计电源 打开后立即倒计时5min 让Modulus 多功能光华 46度计预热。预热后 进行样品检测 仪器默认的方案是1s 的检测时间。 将裂解充分的样品转移到1 5ml 微型管中 并将微型管插入模块中 点击 Measure Luminescence 菜单开始检测 计数。 四、【DNA 转录因子结合实验】 通过在体外 EMSA 或体内 CHIP 的DNA结合实验证实MTF1转录因子能够特异性的与DDAH1基因启动子区 396 4N 缺失型等位基因结合。 主要试剂 核蛋白提取试剂盒 日本Activie Motif公司 BCA法蛋白定量试剂盒 美国Pirce公司 生物素3’末端标记标记试剂盒 美国Pirce公司 EMSA试剂盒 美国Pirce公司 蛋白酶抑制剂 美国Pirce公司 MTF1抗体 美国Santa Cruz公司 CHIP试剂盒 美国 Update生物有限公司 引物合成 北京奥科生物技术有限公司 分子量标准 TaKaRa生物技术有限公司 EB核酸染料 上海赛百盛基因技术有限公司 Agarose凝胶 武汉亚法生物技术有限公司 主要实验仪器 超声破碎仪 美国Fisher科技有限公司 电泳仪 美国Bio Rad公司 美国BioRad公司 9700双96PCR仪 美国ABI公司 电热恒温水浴槽 DK 8D 上海一恒科技有限公司 漩涡混合仪 XW 80A 海门其林贝尔仪器有限公司 47台式离心机 长沙市平凡仪器厂 电泳槽 北京市六一仪器厂 DYY 12电脑三恒多用电泳仪 北京市六一仪器厂 紫外仪 WD 9403B 北京市六一仪器厂 自动凝胶成像分析系统 美国Micro Tech Image公司 电热蒸气压力消毒高压锅 YX 400 上海三申医疗器械有限公司 常见试剂配置方法 TBE在电子天平上分别准确称取54g Tris碱、27 5g硼酸和20 ml EDTApH 置于1L烧杯中加入400ml的去离子水 充分搅拌溶解 然后加入去离子水定容至1L 常温保存备用。 10 APS 在电子天平上分别准确称取过硫酸铵1g 加水定容至10ml 20 保存备用。 30 丙烯酰胺 在电子天平上分别准确称29g丙烯酰胺 lg亚甲双丙烯酰胺 37 下充分搅拌溶解 然后加入去离子水定容至100ml 常温保存备用。 凝胶迁移及超迁移实验 Electrophoretic mobility shift assay EMSA 按照美国Pierce公司LightShift Chemilluminescent EMSA试剂盒说明说要求进行三种细胞系体外DNA 转录因子结合实验。 细胞核蛋白的提取 按照美国Pierce公司核蛋白提取试剂盒提供的说明书要求提取3种细胞系的细胞核蛋白。 首先准备好CERI和NER缓冲液 并按照说明说要求加入美国Pirce公司生产的蛋白酶抑制剂。 取事先在25cm2容量培养的细胞瓶中培养的细胞用预冷的PBS轻轻漂洗2 置于冰上并用用细胞刮棒刮下细胞到15ml离心管中 下500g离心2分钟 弃去上清液 用枪头吸取少量PB吹散细胞并转移到1 5ml的EP管中 下500g再次离心2分钟 然后小心吸弃离心分层的液体。 然后置于在振荡器充分振荡20秒再冰浴10分钟。 向细胞沉淀中加入11μl冰预冷的CERII 置于在振荡器充分振荡5秒 再冰浴1分钟。 在振荡器充分振荡5秒于16000 g冷冻离心2分钟 得到的上清液 胞浆蛋白 到干净预冷的离心管中。 向细胞沉淀中加入10μl冰预冷的NER置于在振荡器充分振荡15秒 再冰浴10分钟。重复步骤5 在振荡器充分振荡5秒 于16000 g冷冻离心2分钟 得到上清液 胞核蛋白 分装到干净预冷的离心管中 80 保存备用。 生物素的标记 使用美国Pierce公司生物素3’末端标记试剂盒 分别标记MTF1结合位点序列的缺失型和插入型寡核苷酸探针 探针名称 核苷酸序列 GGACGATGGGAGGTGTGCACCTGCGACAGAAC396del GTTCTGTCGCAGGTGCACACCTCCCATCGTCC396ins GGACGATGGGAGGTGTGCGTGCACCTGCGACAGAAC396ins GTTCTGTCGCAGGTGCACGCACACCTCCCATCGTCC按照说明书要求 配制其它相关试剂。1 TdT工作液由5 TdT浓缩液稀释获得。按照说明要求向1 5ml干净EP管中依次加入去离子水25μl、5 TdT缓冲液10微升、探针 1μM浓度 5μl、Biotin N4 CTP 5μl、稀释的TdT2U 总体积共50μl然后置于恒温水浴槽中37 下30分钟。加入2 5μl浓度为0 2M的EDTA终止反应后在加入50μl氯仿 置于在振荡器充分振荡5秒后于16000 g冷冻离心2分钟 吸取上清液于干净的1 5ml EP管中。各取10μl单链标记探针90 变性1分钟 然后在30分钟内缓慢冷却至Tm值温度 20 冷冻保存备用。 非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备向30ml小烧杯中依次加入30 丙烯酰胺1 8ml 去离子水11 6ml 5ml10 APS 105并用0 TBE冲洗加样孔TEMED 用吸管轻轻吹打混匀后注入两块玻璃板之间 并注意不要有气泡 立即插入梳子 等待胶凝固约30分钟 轻轻拔出梳子 立即用水冲洗加样孔。然后将凝胶置于用0 TBE灌满电泳槽中并用

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