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江苏大学硕士学位论文方法 细菌鉴定 菌株的复苏与保存从 超低温

发布时间:2019-09-01 14:21 来源:未知 编辑:admin

  江苏大学硕士学位论文方法 细菌鉴定 菌株的复苏与保存从 超低温冰箱中取出原始菌液勿待溶解 挑取少量菌液冰渣分区划线接种于血琼脂平板 甘油肉汤加入适量过夜培养菌液中 保存于 超低温冰箱中。菌株的鉴定挑取血琼脂培养基上新鲜培养的单个菌落在 全自动微生物分析仪进行鉴定。 培养基与溶液的配制 普通肉汤培养基

  江苏大学硕士学位论文方法 细菌鉴定 菌株的复苏与保存从 超低温冰箱中取出原始菌液勿待溶解 挑取少量菌液冰渣分区划线接种于血琼脂平板 甘油肉汤加入适量过夜培养菌液中 保存于 超低温冰箱中。菌株的鉴定挑取血琼脂培养基上新鲜培养的单个菌落在 全自动微生物分析仪进行鉴定。 培养基与溶液的配制 普通肉汤培养基 蒸馏水中加入血液增菌培养基粉 加热溶解后 试管分装 高压 灭菌。 培养基 蒸馏水中加入水解酪蛋白琼脂 加热溶解后 高压 灭菌。无菌条件下 分装。待凝固后 冰箱保存。缓冲液 冰乙酸用蒸馏水定容至 浓盐酸调节 蒸馏水中加入琼脂粉 加热溶解后 试管分装 高压 灭菌。 缓冲液 硼酸、用蒸馏水定容至 氢氧化钠调节 高压灭菌。碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌基因型研究及同源性分析 缓冲液 用蒸馏水定容至氢氧化钠调节 脱氧胆酸、月桂酰基肌氨酸钠 用蒸馏水定容至 氢氧化钠调节 高压灭菌。蛋白酶 裂解液 月桂酰基肌氨酸钠用蒸馏水定容至 氢氧化钠调节 高压灭菌。蛋白酶 溶液 蒸馏水加入含蛋白酶的试剂瓶中 摇匀 冰箱保存。药物敏感试验收集的试验菌株统一采用纸片扩散法 做体外药物敏感性试验。操作步骤如下。 准备药敏纸片药敏纸片头孢吡肟 、头孢噻肟 、头孢他啶 、头孢匹 、阿莫西林 克拉维酸 、复方新诺、妥布霉素 、亚胺培南 、环丙沙星、呋喃妥因 在使用前 冰箱中取出含药敏纸片的包装盒使药敏纸片与室温达到平衡。 采用生长法制备接种物用接种环挑取生长在血琼脂培养基上新鲜的单个菌落 移种于肉汤培养基中 温箱中孵育校正浊度至 号麦氏标准管浊度。 接种平板用灭菌的拭子蘸取菌液 在整个 培养基表面密集涂布 保证涂布均匀。 贴纸片须待培养基上的水分被琼脂完全吸收后再贴药敏纸片。用镊子取纸片一张 贴在 琼脂培养基表面。 孵育贴好纸片后 温箱进行孵育。 结果判读采用 药敏解释标准判读结果见表 标准菌株为大肠埃希菌 。江苏大学硕士学位论文袁 药敏解释标准碳青霉烯酶检测按照 年版 标准文件进行改良 试验 】。操作步骤如下。 准备药敏纸片药敏纸片厄他培南 在使用前 冰箱中取出使药敏纸片与室温达到平衡。 直接菌悬液法用接种环挑取生长在血琼脂培养基上新鲜的大肠埃希菌 标准菌株的菌落 悬浮于生理盐水中 振荡混匀 再与标准比浊管比浊 调至与 号麦氏标准管浊度相同。 接种平板将含有大肠埃希 麦氏浊度单位的菌液稀释 用蘸取菌液的灭菌拭子在整个 培养基表面密集涂布 保证涂布均匀。 贴药片用镊子取一张厄他培南药敏纸片 贴在琼脂培养基中间表面 为使纸片贴平 用镊子轻压一下。 接种用接种环挑取生长在血琼脂培养基上新鲜的受试菌白纸片外缘向 碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌基因型研究及同源性分析平板边缘划线接种 温箱孵育过夜。 结果判读按照 年版 标准文件‘ 进行改良 试验 的结果判读。出现矢状生长者为受试菌阳性 设置阴、阳性对照 型酶肺炎克雷伯菌为阳性对照株大肠埃希菌 为阴性对照株【 检测采用年版 推荐的纸片法表型确证试验 。操作步骤如下。 准备药敏纸片头孢他啶、头孢噻肟纸片和头孢他啶 克拉维酸、头孢噻肟 克拉维酸复合物纸片 在使用前 冰箱中取出含药敏纸片的包装盒使药敏纸片与室温达到平衡。 采用生长法制备接种物用接种环挑取生长在血琼脂培养基上新鲜的单个菌落 接种于 肉汤培养基中 孵育校正浊度至 号麦氏标准管浊度。 接种用蘸取菌液的灭菌拭子 在整个 培养基表面密集涂布 保证涂布均匀。 贴纸片须待培养基上的水分被琼脂完全吸收后再贴药敏纸片。用镊子取一张纸片 贴在 琼脂培养基表面 为使纸片贴平 轻压一下。 孵育贴好纸片后 温箱进行孵育。 结果判读采用 年版 推荐的纸片法表型确证试验【 的标准判读结果。当任何一种复合物纸片抑菌环直径大于或等于其单独药敏纸片抑菌环直径 可确证该菌株产 标准菌株大肠埃希菌 细菌模板制备采用煮沸法提取试验菌株的 。操作步骤如下。 将试验菌株接种至 营养肉汤 培养离心 弃去上清液。 生理盐水于细菌沉淀中震荡悬菌 离心 弃上清液 如此重复洗 无菌蒸馏水重新震荡悬菌后置 水浴离心 取上清液即为 扩增所用的模板 以下保存备用。江苏大学硕士学位论文耐药酶基因检测 采用 法检测试验菌株的耐药基因 反应体系 见表。扩增条件 琼脂糖凝胶电泳后成像拍照出现与阳性对照菌株相同的目的条带则为阳性。袁 反应体系 组成体积模板 上游引物 下游引物 扩增产物测序及序列分析阳性 扩增产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司用测序仪进行双向测序。测序结果经 数据库提供的已知序列进行比对分析确定其基因型。 脉冲场凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳的操作步骤如下。 将保存的试验菌株接种在肉汤培养基内 增菌培养然后菌悬液接种在血琼脂培养基上 挑取血琼脂平板上新鲜培养的单个细菌菌落于液体培养基中 振摇过夜。 将菌液全部倒入离心管 离心 弃上清。用 混匀沉淀 制成菌悬液 调浊度至 个麦氏单位。 配制低熔点胶 将混匀后的含菌低熔点胶加入模具中制成胶块 放入 将同一菌株的胶块吹入同一个离心管中。 蛋白酶 裂解液 蛋白酶 溶液 吸干裂解液加入 室温静置 。吸干再用 重复洗 冰箱保存备用。用刀片切半块胶至 离心管中 加入 吸去然后加入 酶切反应体系 见表 过夜酶切。表酶切反应体系 组成体积 将酶切过夜的半块胶放在梳子上对齐下缘 吸干多余的水分 干燥 配制级琼脂糖 温箱用作封口胶然后将冷却至 胶缓慢倒入模具中冷却凝固半小时后 拔出梳子 用封口胶封口 凝固。将肺炎克雷伯菌选作为 与样本相同步骤处理。 脉冲场电泳系统电泳缓冲液作为电泳液。电泳参数为 电压 分子量 度角 脉冲 电泳时间 用凝胶成像系统观察拍摄。判断标准 参照美国疾病控制和预防中心 等推荐的方法 图谱完全相同为一个型 彼此之间相差一个带为同一型的不同亚型 相差 个带为亲缘关系密切 相差 相关条带相差 个以上的为无亲缘关系‘ 。结果 药敏试验结果 株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌对头孢噻肟和阿莫西林 克拉维酸耐药率最高 均为 对环丙沙星、复方新诺明、四环素、头孢他啶、头孢西丁、氨曲南、亚胺培南和厄他培南的耐药率在 之间 株耐药株其中对替甲环素耐药细菌分别为 株产气肠杆菌。株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌药敏试验结果见表 改良试验及 表型试验结果 株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌中 共检出产碳青霉烯酶细菌 试验阳性 。各种细菌碳青霉烯酶和的检出结果见表 改良 试验阳性和阴性结果见图 。碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌基因型研究及同源性分析表 株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌碳青霉烯酶和 的检出率 为阳性对照菌株为试验阳性菌株 为阴性对照菌株图 改良 试验 检测耐药酶基因及测定序列的结果 株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌中 分别有 等碳青霉烯酶基因分别有 基因分别有 酶基因。其中株大肠埃希菌中检出 哟株菌携带 基因 分别有 基因分别有 基因。株阴沟肠杆菌中分别检出 煳株菌携带江苏大学硕士学位论文 基因分别有 呦株携带基因。 株产气肠杆菌检出 基因阳性。株柠檬酸杆菌检出 等其他基因型。株摩根摩根菌和 株奇异变形杆菌中未检出碳青霉烯酶和 等基因。 株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌基因型检测结果见表 耐药基因 产物电泳图见图 基因 产物部分测序结果图见图 标准带分别为 酶阳性菌株为阴性菌株图 耐药基因 产物电泳图 基因产物部分测序结果图 碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌基因型研究及同源性分析袁 株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌基因型检测结果 菌株名称垒 数出数出数出数出数出数出数出数出率率率率率率率率蚴蚴蚴蚴始蚴嫂幽大肠埃希菌阴沟肠杆菌 产气肠杆菌 摩根摩根菌柠檬酸杆菌 奇异变形杆菌 合计 脉冲场凝胶电泳 结果经 根据等的方法对 株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌进行 条带进行分型【 分为 个亚型。其中型分为 种亚型、 型分为 种亚型、 型分为 种亚型。 型为主 共有 为实验菌株图同源性分析电泳结果图

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